熱不穩(wěn)定性耐高鹽核酸酶

無論是實(shí)驗(yàn)室規(guī)模樣品制備、還是生產(chǎn)規(guī)模工藝過程，去除核酸都可以改善工藝流程，如蛋白純化、病毒載體制備、mNGS中樣品處理等過程。而核酸酶的選擇，就顯得特別重要。Heat Labile-Salt Active Nuclease (熱不穩(wěn)定性耐高鹽核酸酶，HL-SAN) 是一種非特異性內(nèi)切酶，在高鹽濃度下具有最佳活性；且該酶在多種緩沖液中都有活性，很容易通過還原劑處理而失活。這些特性使HL-SAN在需要去除DNA和RNA的應(yīng)用中，更為適合。

核酸污染，特別是宿主基因組DNA污染，在幾乎所有工藝流程及生物制品的生產(chǎn)中，都是需要重點(diǎn)解決的問題。一方面，宿主DNA的存在，影響目標(biāo)產(chǎn)物的純化及下游質(zhì)量分析等。另一方面，宿主DNA殘留能引起機(jī)體嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，是生物制品的關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)之一，F(xiàn)DA及NMPA等對Host Cell DNA (HCD)有嚴(yán)格的質(zhì)控要求。宿主基因組DNA中，組蛋白與DNA形成核小體，核小體緊密折疊形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的染色質(zhì)。組蛋白與DNA間存在強(qiáng)烈的離子作用及疏水作用，再加上特殊的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致宿主DNA很難被準(zhǔn)確檢測并清除。已有文獻(xiàn)表明，高鹽濃度下組蛋白與DNA解離相對徹di，這有利于宿主DNA的檢測及去除。但市售的絕大多數(shù)核酸酶在高鹽濃度下活性很弱，甚至wan全失活。而熱不穩(wěn)定性耐高鹽核酸酶，HL-SAN成了這類應(yīng)用的理想選擇。

高鹽條件下，DNA清除效率更高，宿主DNA殘留更少；

pI為9.6，容易跟絕大多數(shù)蛋白分離；

還原劑存在時，酶易失活，減少對后續(xù)流程的影響。

圖 1：高鹽度溶液中的最佳活性。HL-SAN 在約 0.5 M NaCl 下具有最佳活性，但在 [NaCl] 和 [KCl] 的廣泛范圍內(nèi)運(yùn)行。HL-SAN 的活性在 25 mM Tris-HCl 緩沖液、pH 8.5、5 mM MgCl 2 和不同的 [NaCl] 或 [KCl] 中測試。最大活性設(shè)置為 100%。

圖 2：溫度和活動。HL-SAN 在 ~35°C 時具有最佳活性，但在很寬的溫度范圍內(nèi)起作用（10°C 和 50°C 下的活性為 20%）。在含有 5 mM MgCl 2 和 0.5 M NaCl 的pH 8.5 的 25 mM Tris-HCl 緩沖液中測試 HL-SAN 的活性。

圖 3： MgCl 2 和 MnCl 2 濃度對 HL-SAN 活性的影響。

在 25 mM Tris-HCl 緩沖液、pH 8.5、0.5 M NaCl 和不同濃度的 MgCl 2 或 MnCl 2 中測試 HL-SAN 的活性。將含有 5 mM MgCl 2的樣品的活性 設(shè)為 100%。

圖 4： HL-SAN 將 ssDNA 消化為 ~5-13 nt，將 dsDNA 消化為 ~5-7 nt。ssDNA 最終產(chǎn)物的大小從 ~5-13 nt 不等，而 dsDNA 被消化到大約 ~5-7 nt。最終產(chǎn)物的大小似乎取決于 DNA 序列。底物 1 和 2 是具有不同序列的 ssDNA，底物 3 和 4 是具有相似序列但在不同末端具有 FAM 標(biāo)記的 dsDNA。底物 5 是 dsDNA，其序列與底物 3 和 4 相同，但兩端帶有 FAM 標(biāo)記。

病原微生物檢測應(yīng)用，如宏基因組測序（mNGS）樣品去除宿主DNA；

蛋白純化，特別是DNA結(jié)合蛋白；

病毒載體制備，如腺相關(guān)病毒（AAV）、腺病毒（AdV）等；

其他需要去除宿主DNA的應(yīng)用等。

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本產(chǎn)品主要用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

來源：在畢赤酵母中重組生產(chǎn)。

活性：HL-SAN在10-50°C的溫度范圍內(nèi)具有高活性。 活動的最佳 NaCl 濃度為 0.5 M，工作范圍為 0.25–1 M?；顒有枰?Mg2+ (>1 mM)。 工作 pH 范圍為 7.5-9.5，最佳 pH 值為 9.0。

比活度：≥ 175 000 Units/mg。

單位定義：一個單位定義為在 37°C 下 30 分鐘內(nèi) 1 A 在 260 nm 處的吸光度增加，使用 50 μg/ml 小牛胸腺 DNA（D-1501，Sigma）在由 25 mM Tris-組成的緩沖液中 HCl，pH 8.5 (25°C)，5 mM MgCl2，500 mM NaCl。